Die Polymerase-Kettenreaktion

Überblick

 

Definition

 

PCR ist eine Abkürzung für Polymerase Chain Reaction (engl.), einem Verfahren welches im deutschsprachigen Raum als Polymerase-Kettenreaktion bezeichnet wird.

Ziel einer solchen Polymerase-Kettenreaktion ist es die DNA, also Erbsubstanz, zu vervielfältigen. Zum Beispiel ist dies notwendig, wenn von dieser DNA keine ausreichende Menge zur Verfügung steht.

 

PCR einfach erklärt

 

Bricht man den Namen in seine Bestandteile auf, erklärt sich das zugrundeliegende Prinzip dieses Verfahrens:

Ein Enzym namens „DNA-Polymerase“ wird innerhalb einer biochemischen Reaktion benutzt. Zusätzlich handelt es sich um eine Kettenreaktion: das Endprodukt der Reaktion dient gleichermaßen als Ausgangspunkt für eine weiter, gleichartige Reaktion.

 

Der Ablauf einer PCR

 

Wie funktioniert eine PCR?

Die PCR kann in drei Abschnitte unterteilt werden: Denaturierung, Primerhybridisierung und Elongation.

PCR Diagramm Abb.1.: Eine Polymerase-Kettenreaktion wird in drei charakteristische Schritte eingeteilt. Während der Denaturierung erfolgt eine Trennung der beiden DNA-stränge. Darauf folgt die Primerhybridisierung bei der die Primer an ihre jeweiligen Ausgangsmatrizen binden. Zum Schluss erfolgt die Synthese des "neuen Materials" während der Elongation .

 

Im ersten Schritt, der Denaturierung, werden die beiden Einzelstränge der doppelsträngigen DNA mithilfe von Hitze voneinander getrennt. Dabei brechen die Wasserstoffbrückenbindungen, die zuvor beide Stränge zusammen gehalten haben.

Für den nächsten Schritt, der Primerhybridisierung, sind Primer notwendig. Primer sind Oligonukleotide. Diese wurden so ausgewählt, dass sie an einen bestimmten Abschnitt innerhalb des zu vervielfältigen Strangs binden (hybridisieren).

Das PCR Primer Design spielt eine besondere Rolle im Verlauf einer PCR. Hierbei ist auf verschieden Kriterien zu achten, damit eine fehlerlose Bindung an die Ausgangs-DNA möglich ist. Nicht selten werden daher mehrere Variante erstellt und in der Praxis getestet.

Die Polymerase kann im nächsten Schritt dann an diese Primer binden und damit beginnen die DNA zu replizieren.

Der Prozess der eigentlichen Vervielfältigung wird als Verlängerung, Elongation oder Amplifikation bezeichnet. Hierbei wandert DNA-Polymerase Stück für Stück die Nukleotide des DNA-Einzelstranges ab. Währenddessen erstellt Sie mithilfe von freien Nukleotiden (Desoxy-Nukleotiden = dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ein komplementäres Gegenstück zum Ausgangsstrang. Dieser stellt somit eine identische Kopie des anderen Einzelstranges dar.

Jeder dieser Prozesse weist eine besondere Temperatur auf. Dies ist daher auch der Grund das eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird wie zum Beispiel die Pfu- oder die Tag-Polymerase. Außerdem ist ein ständiger Wechsel je nach Reaktionsschritt und Zyklus nicht manuell möglich, daher wird eine PCR in einem sogenannten Thermocycler durchgeführt. Wie der Name schon beschreibt, handelt es sich hierbei um eine PCR Maschine, die unterschiedliche Temperaturen in definierten Zyklen durchläuft.

 

Eine Auswahl unserer DNA-Polymerasen

 

Produkt Hersteller Art. Nr. Menge
TAQ DNA POLYMERASE

GenScript

E00007-1000
E00007-50000

1000.0U
50000.0U

 
RECOMBINANT TAQ DNA POLYMERASE

Prospec

enz-308-1,000U
enz-308-3,000U
enz-308-10,000U

1,000U
3,000U
10,000U

 
EXPRIME TAQ DNA POLYMERASE (WITH DNTP MIXTURE AND 10X RXN BUFFER (WITH MG))

BioBiz

G-1000

1,000U

 
HS PRIME TAQ DNA POLYMERASE (WITH 10MM DNTP MIX., 25MM MGCL2 & 10X RXN BUFFER(MG FREE))

BioBiz

G-7000XX

250 Units

 
TAQ DNA POLYMERASE (RECOMBINANT)

Abbexa

abx073521-1000
abx073521-3000
abx073521-10000

1,000U
3,000U
10,000U

 
TAQ DNA POLYMERASE, 5U/­UL

Bio Basic

BB-B0089-200
BB-B0089-500
BB-B0089-5x200
BB-B0089-1
BB-B0089-5x1000

200U
500U
5x200U
1000U
5x1000U

 
FAST-­TAQ DNA POLYMERASE WITH 10MM DNTP MIX

Bio Basic

BB-9K-001-0003
BB-9K-001-0004

500U
2500U

 
HIGH-­TAQ DNA POLYMERASE WITH 10MM DNTP MIX

Bio Basic

BB-9K-001-0005
BB-9K-001-0005

250U
4x250U

 
AT TAQ DNA POLYMERASE (HOTSTART -­ 5U/­UL)

Pop-Bio

POV-PL3201
POV-PL3202

200U
500U

 
HOTSTART TAQ DNA POLYMERASE (5U/­UL)

Biomatik

BM-A4144-250U

250U

 

 

Um den Ablauf einer PCR so einfach wie möglich zu gestalten wird oft ein PCR Mastermix verwendet. Solch ein PCR Mastermix enthält die DNA-Polymerase, einen passenden Reaktionspuffer, sowie die benötigten Nukleotide, die als Bausteine für die neuen „Kopien“ dienen.

 

Eine Auswahl unserer PCR-Mastermixe

 

Produkt Hersteller Art. Nr. Menge
EZWAY MULTIPLEX PCR MASTERMIX (2X)

Komabiotech

K0567810

1 ml

 
EZWAY MULTIPLEX PCR QMASTERMIX (2X)

Komabiotech

K0567820

1 ml

 
2X HOTSTART TAG PCR MASTERMIX WITH LOADING DYE

Tools Biotech

BTL-KTT-BB02

1 ml

 
EXPRESS HI FI DNA POL, 2X MASTERMIX

Biomiga

BMG-EHF1102-01

BMG-EHF1102-02

2,5 ml (100 Reactions)
12,5 ml (500 Reactions)

 
VIPRIMEPLUS ONESTEP QRT-­PCR MASTERMIX

Pop-Bio

POV-QLMM03

1ea

 
GENEKAM PCR MASTERMIX SOLUTION (2X) 1000 REACTIONS

Genekam-Biotechnology

GEK-SB0012

10 ml

 

 

Einsatz eines PCR Tests zur Erkennung von Krankheiten

 

Nicht nur für die Vervielfältigung von DNA für ein anstehendes Experiment kann die PCR Methode von Vorteil sein.

Erbkrankheiten sind bedingt durch Veränderung im Genom. Mithilfe einer PCR kann das spezifische Gen vervielfältigt werden. Im Anschluss folgt dann eine Sequenzierung des Materials wodurch eine mögliche Mutation detektiert werden kann.

Auch bei der Diagnose viraler Erkrankungen wie einer Infektion mit dem HI-Virus kann ein PCR Test helfen. Hierbei wird die Virus-DNA vervielfältigt und kann danach untersucht werden. Handelt es sich um RNA-Viren wird die RNA durch eine Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. So ist eine Amplifikation mittels PCR wie zuvor beschrieben möglich (RT-PCR).

 

HIV-PCR Test

 

Auch für den Nachweis von HIV kann ein PCR Test eingesetzt werden. Dabei bietet er einen zentralen Unterschied zu anderen Tests an: Während andere Test den Nachweis von Antikörpern durchführen, wird bei einem HIV-PCR Test der HI-Virus detektiert.

Herauszustellen ist hierbei jedoch, dass dieser HIV-PCR Test eher im Kontext einer Therapie, oder im Zusammenhang mit einem Antikörper-Suchtest als Kontroll-Test genutzt wird. Hierbei soll das zuvor erlangte Ergebnis lediglich erneut bestätigt werden.

 

Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

 

Ähnlich wie die PCR wird auch die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in drei Schritte unterteilt: Aufreinigung der RNA, reverse Transkription der RNA in DNA und Amplifikation der so generierter cDNA.

Während wir zuvor die Polymerase kennen gelernt haben, folgt in dieser Variante der PCR die Einführung eines weiteren Enzyms: die Reverse Transkriptase. Diese stammt ursprünglich aus Retroviren. Für die industrielle Nutzung wird dieses allerdings Enzym weiter verändert. So wurde zum Beispiel meist dessen RNase H-Aktivität entfernt.

Bei der Reversen Transkriptase handelt sich auch um eine DNA-Polymerase. Der Unterschied zur „normalen“ Polymerase besteht allerdings darin, dass die Reverse Transkriptase RNA als Ausgangsmaterial benötigt. Sie wird daher auch als RNA-abhängige DNA-Polymerase bezeichnet. Mithilfe eines DNA-Primers kann diese dann die sogenannte Komplementär-DNA (cDNA) erstellen.

Der Unterschied zwischen DNA und cDNA besteht darin, das letztere keine Introns aufweist. Dies ist durch die Tatsache begründet, dass cDNA mittels eines RNA-Strangs erzeugt wird, welcher bereits den Splicing-Prozess durchlaufen hat.

 

Eine Auswahl unserer Produkte für die RT-PCR

 

Produkt Hersteller Art. Nr. Menge
One-­Step RT-­PCR Kit

Biomiga

BMG-RT0201-00
BMG-RT0201-01
BMG-RT0201-02

5 Reactions
25 Reactions
100 Reactions

 
One Step RT PCR Kit (cDNA Synthesis + PCR In One Reaction)

Boster

BOS-MB1003

100 Reactions

 
GENEKAM RT MASTER MIX

Genekam Biotechnology

GEK-K272

100 Reactions

 

 

Real Time Quantitative PCR

 

Bei der Real Time Quantitative PCR (kurz qPCR) handelt es sich um eine übliche PCR, bei der zusätzlich die synthetisierte DNA quantifiziert wird. Der Begriff „Real Time“ bezieht sich dabei auf den Quantifizierungs-Prozess: Mittels Fluoreszenz wird die Zunahme des Materials in Echtzeit gemessen.

Eine Möglichkeit besteht dabei zum Beispiel in der Verwendung von DNA-Farbstoffen. Gebräuchlich sind unter anderem Ethidiumbromid oder SYBR Green I. Nach erfolgreicher Synthese des komplementären Strangs steht das Ausgangsmaterial wieder als Doppelhelix-Strang zur Verfügung. Die entsprechenden Farbstoffe können dann in die DNA interkalieren und färben diese somit an. Die Zunahme an synthetisierten Material ist dabei proportional zur Fluoreszenz-Intensität des Reaktionsansatzes.

 

Eine Auswahl unserer Produkte für die Real Time Quantitative PCR

 

Produkt Hersteller Art. Nr. Menge
SYBR GREEN I NUCLEIC ACID GEL STAIN

ChemScene

CS-0084765-100ug
CS-0084765-500ug

100 µg
500 µg

 
Prime Q-­Master Mix (2X conc. with SYBR Green I)

BioBiz

Q-9200

100 ml

 
SUPRIMESCRIPT QRT-­PCR KIT (FOR TAQMAN PROBE, 2X CONC., WITH ROX DYE)

BioBiz

Q-5100

100 Reactions

 
SYBR GREEN I NUCLEIC ACID GEL STAIN

MedChem Express

HY-K1004-100uL
HY-K1004-500uL

100 µl
500 µl

 
RT MASTER MIX FOR QPCR

MedChem Express

HY-K0510-1mL
HY-K0510-5mL

1 ml (100 Reactions)
5 ml (5x 100 Reactions)

 
KOD SYBR QPCR MIX

Cosmobio

TYB-QKD-201T
TYB-QKD-201

1 ml
3*1.67 ml

 
FAST EVAGREEN MASTER MIX FOR QPCR(200 RXN)

Biotium

B-31003-T
B-31003
B-31003-1
B-31003-2

1 ml
2*1 ml
5*1 ml
50*1 ml

 
CYBRFAST 1-­STEP RT-­QPCR HI-­ROX KIT

Tonbo Biosciences

31-5202-0100R

100 Reactions

 
VALIDATED FLUORESCENT PROBES FOR REAL-­TIME QUANTITATIVE PCR (TAQMAN PROBE: FAM-­BHQ1)

GenePharma

GP-F01001

200 Reactions

 

 

Real Time Quantitative PCR für den Nachweis von SARS-CoV-2

 

Angesichts der schnellen Ausbreitug von SARS-CoV-2 ist die Nachfrage nach direkten und indirekten Nachweismethoden für COVID-19 weltweit rasant angestiegen. Zu den indirekten Nachweismethoden zählen serologische Test, die entweder auf einem SARS-CoV-2-Antikörpernachweis oder einem SARS-CoV-2-Antigennachweis basieren. Meist müssen solche Test allerdings mit einem direkten Virusnachweis kombiniert werden. Die RT-qPCR ist hierbei der am weitesten verbreitete Test.

 

Eine Auswahl unserer Produkte für den Nachweis von SARS-CoV-2 mittels RT-qPCR

 

Produkt Hersteller Art. Nr. Tests/RXNs
Novel Coronavirus 2020 (Wuhan Strain specific) Realtime PCR

Genekam Biotechnology

GEK-FR475

100 Tests

SARS-­CoV-­2 qPCR detection 1-­plex assay-­ORF1ab
SARS-­CoV-­2 qPCR detection 1-­plex assay-­N
SARS-­CoV-­2 qPCR detection 1-­plex assay-­RdRP
SARS-­CoV-­2 qPCR detection 1-­plex assay-­E

GenScript

SC1618-ORF1ab
SC1618-N
SC1618-RdRP
SC1618-E

100 rxns
100 rxns
100 rxns
100 rxns

ABScript II One Step RT-­qPCR Probe Kit

Abclonal

RK20407-20rxn
RK20407-100rxn

20 rxns
100rxns

Coronavirus (SARS-­CoV-­2) Real Time RT-­PCR Nucleic Acid Detection Kit

Raybiotech

PCR-COV

20 Tests

COVID-­19 RT-­qPCR Rapid Detection Kit

ABM

ABM-G628

100 rxns

 

Mögliche PCR Fehlerquellen

 

Es gibt Zahlreiche Dinge, die bei einer PCR schief laufen können (aber nicht müssen).

So spielt meiste die richtige Konzentration der einzelnen Reagenzien eine wichtige Rolle. Besonders sollte hier auf die dNTPS, die MgCl-Lösung, die Polymerase und das Template geachtet werden.

 

TIPP: Vor allem als Laborneuling hilft es sich mit den Kolleginnen und Kollegen auszutauschen und nach deren Standard PCR-Protokoll zu fragen. Diese sind meist schon lange etabliert. Bei der Gelegenheit darf man eventuell sogar deren entsprechend voreingestelltes Thermocycler Programm mitbenutzen.

 

Denn auch ein falsches Thermocycler-Programm kann eine mögliche PCR Fehlerquelle sein.

Wenn die DNA-Polymerase allerdings gar nicht mit der Arbeit beginnen kann bei einer PCR auch kein Material vervielfältigt werden. Dies kann zum Beispiel an einem fehlerhaften Primer-Design liegen.

 

TIPP: Es ist empfehlenswert zu Beginn des Experiments mehrere Primer-Pärchen synthetiseren zu lassen. So hat man immer ein Back-Up falls ein Paar nicht funktioniert und falls doch alle binden hat man eine zusätzliche Kontrolle eingebaut.

 

Häufig gestellte Fragen:

 

Was ist ein PCR Test?

Ein PCR Test ist ein Nachweis-Test bei dem die Anwesenheit von einer spezifischen DNA (oder RNA) mittels dessen Amplifikation gezeigt wird.

 

Was ist PCR Diagnostik?

In der Diagnostik kann mittels eines PCR Test z.B. ein zugrunde liegender Gendefekt nachgewiesen werden.

 

Wie lange dauert ein PCR Test?

Die Dauer eines PCRT Test hängt von der Anzahl der verwendeten Zyklen ab.

 

Wer hat die PCR erfunden?

Kary Mullis ist der Erfinder der PCR.

 

Was ist ein Primer in der Biologie?

Ein Primer ist ein Oligonukleotid. Dieses einzelsträngige DNA Fragment dient als Startpunkt für die DNA-Polymerase und wird gezielt innerhalb einer PCR eingesetzt.

 

Welches Enzym entfernt die Primer?

Die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der Polymerase I oder die RNase H entfernt Primer bei Prokaryoten.

 

Warum gibt es Okazaki Fragmente?

Bedingt durch die 5‘-->3‘ Syntheseaktivität der DNA-Polymerase werden am Folgestrang (komplementär zum Leitstrang) diskontinuierliche, kleine DNA Fragmente generiert. Diese Abschnitte werden als Okazaki Fragmente bezeichnet.