Plasmidpräparation

Überblick

 

Was ist eine Plasmidpräparation?

 

Neben dem Bakterienchromosom besitzen Bakterien sogenannte extrachromosomale Plasmide auf denen Gene enthalten sind. Charakteristisch für Plasmide ist deren Ringform. Bei ihnen handelt es sich um doppelsträngige DNA-Moleküle, die in der Lage sind sich selbst zu replizieren. Hierfür weist ein Plasmid eine Sequenz, die als Replikationsursprung (engl.: Origin of Replication, kurz ORI) bezeichnet wird, auf.

In der modernen Wissenschaft werden Plasmide genutzt, um zum einen genetisches Material innerhalb von Bakterien zu vervielfältigen und zum anderen um fremde Gene in andere Organismen zu übertragen.

Der Prozess bei dem die Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien isoliert wird heißt Plasmidpräparation.

 

Warum macht man eine Plasmidpräparation?

 

Eine solche Plasmidpräparation erlaubt es Wissenschaftler in vitro, das heißt außerhalb der Zelle, mit der Plasmid-DNA zu arbeiten.

Der gesamte Prozess der Plasmidpräparation kann in zwei Teilschritte unterteilt werden. Zunächst erfolgt die Freisetzung des Zellinhalts durch die Zerstörung der Zellwände. Dieser Schritt wird auch als „aufschließen“ der Zelle bezeichnet. Anschließend wird der erhaltene Zellextrakt so behandelt, dass alle Bestandteile bis auf die gewünschte Plasmid-DNA entfernt werden.

 

Welche Arten von Plasmidpräparations Kits existieren?

 

Plasmidpräparations Kits stellen dem Wissenschaftler alle nötigen Werkzeuge zur Verfügung, um eine solche Plasmidpräparation durchführen zu können. Anhand der isolierbaren Plasmid-DNA Menge werden diese Kits in vier Gruppen eingeteilt.

Ein Minipräp Kit erlaubt die Isolation von bis zu 25 µg Plasmid-DNA.

Für Mengen bis zu 0,5 mg kommen Midipräp Kits zum Einsatz.

Größere Mengen bis zu 2 mg werden mithilfe eines Maxipräp Kits isoliert.

Reichen diese Plasmid-DNA Mengen nicht aus kann auch eine Gigapräp Kit verwendet werden, welches bis zu 2 mg Plasmid-DNA isolieren kann.

 

Eine Auswahl unserer Plasmidpräparations Kits

 

Produkt Hersteller Art. Nr. Menge
QuickClean II Plasmid Miniprep Kit

GenScript

L00420-50

50 rxns

Plasmid DNA Extraction Mini Kit (100prep)

Favorgen

FAPDE100
FAPDE001

100 preps
100 preps

QuickPure Plasmid Mini kit

CoWin Biosciences

FAPDE100

200 rxns

EZ-10 Spin Column Endotoxin-Free Plasmid DNA Mini-Preps Kit

Bio Basic

BB-BS71918

50 preps

FavorFilter Plasmid Midi SP Kit (25prep)-­spin column

Favorgen

FAPDE005-M-025

25 preps

GoldHi EndoFree Plasmid Midi Kit

CoWin Biosciences

CWB-CW2581S

10 rxns

Plasmid DNA Maxi Endotoxin Removal kit(10prep)-spin column

Favorgen

FAPDE005C-010

10 preps

GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit

CoWin Biosciences

CWB-CW2104M

10 rxns

EZ-500 Spin Column Endotoxin-Free Plasmid DNA Maxi-Preps Kit

Bio Basic

BB-SK1250

20 preps

 

Welche Unterschiede gibt es bei einer Plasmidpräparation?

 

Die Durchführung einer Plasmidpräparation kann mittels alkalischer Lyse oder Koch-Lyse geschehen. Wie am Namen bereits zu erkennen, unterscheiden sich beide Vorgehensweisen in der Methodik zur Lyse der bakteriellen Zellwand.

Bei der alkalischen Lyse wird ein Detergenz namens Sodiumdodecylsulfat (SDS) verwendet, um die bakterielle Zellwand aufzulösen und so den Inhalt zugänglich zu machen. Die Zugabe von Natriumhydroxid bewirkt anschließend einen Anstieg des pH-Werts ins Alkalische. Dies hat zur Folge, dass sich die zwischen den DNA-Strängen befindlichen Wasserstoff-Brückenbindungen lösen. Im Gegensatz zur chromosomalen DNA ist die Plasmid-DNA allerdings in der Lage im Anschluss komplett zu renaturieren. Die übrig bleiben Bestandteile werden nun einfach abzentrifugiert, sodass die Plasmid-DNA im Überstand zurückbleibt.

Im Falle der Koch-Lyse wird die bakterielle Zellwand mithilfe des Enzyms Lysozym aufgelöst. Es folgt die Denaturierung der bakteriellen Proteine Mittels Isopropylalkohol. Auch bei dieser Vorgehensweise werden die chromosomale DNA und denaturierten Protein abzentrifugiert und die Plasmid-DNA aus dem Überstand gewonnen.