Mouse in vitro Fertilization

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Sperm diluent for in vitro fertilization

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Maus in vitro Fertilisation:

Für die Maus in vitro Fertilisation wird zunächst in die geschlechtsreife, weibliche Maus das Hormon PMSG, gewonnen aus trächtigen Stuten, injiziert, um eine Superovulation auszulösen. Im Anschluss folgt die Injektion von humanem Choriongonadotropin (hCG). Um die Platten vorzubereiten, wird mittels eine Mikropipette etwas Medium auf die Platte gegeben und der Medium-Tropfen mit flüssigem Paraffin bedeckt. Spezifischer kann die Plattenvorbereitung in die Präparation der Sperma Platte, der Fertilisations Platte und der Wasch Platte unterteilt werden. Um die Sperma Platte vorzubereiten wird ein Tropfen FERTIUP PM (hergestellt von Cosmobio) statt Medium verwendet. Dieser Tropfen wird ebenfalls mit flüssigem Paraffin überschichtet. Analog wird mit einem Tropfen CARD MEDIUM (hergestellt von Cosmobio) vorgegangen. Für die Vorbereitung der Wasch-Platte werden vier Tropfen mHTF auf eine Platte gegeben und in flüssigem Paraffin eingeschlossen.

Um Spermatozoen zu sammeln wird der Schweif des Nebenhodens einer geschlechtsreifen, männlichen Maus in eine Sperma-Platte gelegt, die Samenleiter durchtrennt und mittels einer Präpariernadel die Spermien freigesetzt. Die Spermatozoen-Klumpen werden dann mittels der Präpariernadel in den FERTIUP-Tropfen überführt. Darauf folgt eine 60 minütige Inkubationsphase.

Für die Sammlung von Oozyten werden die Eileiter einer superovulierenden, geschlechtsreifen Maus auf die Fertilisations-Platte überführt. Mittels einer Präpariernadel werden dann die Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) freigelegt und in den Tropfen CARD MEDIUM überführt. Darauf folgt eine 30-60 minütige Inkubationsphase.

Für die Besamung werden etwa 3µl der Spermien-Suspension in das COC-enthaltende CARD MEDIUM überführt. Nach einer dreistündigen Inkubationsphase werden die Oozyten dreimal mit mHTF in der Wasch-Platte gewaschen (jeweils in einem der der vier Tropfen). Bei dem Transfer der Oozyten aus der Fertilisations-Platte sollte dabei darauf geachtet werden, das kein CARD MEDIUM mit überführt wird. Im dritten mHTF-Waschschritt werden die Oozyten sechs Stunden nach der Besamung  untersucht und alle parthenogenen Oozyten, die nur einen Pronukleus aufweisen, aussortiert. Befruchtete Oozyten weisen zwei Pronuklei, einen männlichen und einen weiblichen auf. Danach wird eine Übernachtkultur der Oozyten angelegt.

Am nächsten Tag werden lediglich die Zwei-Zell-Stadien in den letzten der vier Tropfen mHTF der Wasch-Platte überführt. Anschließend ist ihrer Vitrifizierung, ihr Transfer in ein Empfänger-Weibchen, oder ihre Kultivierung bis hin zum Blastozysten-Stadium möglich.

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