In vivo Antikörper

In vitro vs. In vivo

Zu Beginn stellt sich eine zentrale Frage: Was bedeutet eigentlich „in vitro“ und „in vivo“?

Beide Begriffe stammen aus dem Lateinischem. In vitro bedeutet ‘im Glas‘ (lat. vitrum). Dabei denkt man in der Biologie und Chemie direkt an ein Reagenzglas und genau das ist auch gemeint.

Ein in vitro Experiment wird außerhalb eines lebenden Organismus durchgeführt.

Der Begriff „in vivo“ hingegen ist das genaue Gegenteil. Er besagt, dass etwas in einem Lebewesen geschieht (lat. vivum = Leben). Demnach werden bei in vivo Experimenten Untersuchungen in einem Lebenden Organismus durchgeführt.

Meist finden in vivo Experimente im Anschluss an neu gewonnen in vitro Erkenntnisse statt. Dies liegt an der Komplexität von Lebewesen, die die unter geregelten, fest definierten Umständen erlangten in vitro Beobachtungen auf die Probe stellt.

Die bekanntesten Anwendungen für in vitro Anwendungen sind die In-vitro-Fertilisation (IVF), bei der eine künstliche Befruchtung einer Eizelle mit Spermien durchgeführt wird und zum anderen die In-vitro-Diagnostik (IVD). Letztere umfasst die Untersuchung von menschlichen Proben innerhalb eines Labors zum Zwecke der Diagnose von vorliegenden Auffälligkeiten oder sogar Krankheiten mithilfe von Produkten den sogenannten Diagnostika.

 

In vivo Antikörper Herstellung

Für die in vivo Produktion von monoklonalen Antikörpern wird zunächst ein Adjuvans in die Bauchhöhle der Maus injiziert. Eine solche Injektion führt zu einer Reizung des Bauchfells. Die daraus resultierende Flüssigkeitsansammlung im Bauchraum wird als Aszites bezeichnet.

Außerdem wird zusätzlich Flüssigkeit in die Bauchhöhle des Tieres sekretiert, was zu einer Förderung des Wachstums von Aszites führt.

Ist dieser erste Schritt abgeschlossen folgt eine weitere Injektion in die Bauchhöhle. Hierbei wird eine konzentrierte Hybridoma-Zellsuspension, entsprechend dem gewünschten monoklonalen Antikörper, verwendet.

Die Hybridomazellen passen sich nun an die neue Umgebung an, fangen an zu wachsen und es kommt zu einer durchgehenden Sekretion von monoklonalen Antikörpern in die Aszitesflüssigkeit innerhalb der Bauchhöhle.

Zum Schluss kann die Azitesflüssigkeit entnommen werden. Meist folgt im Anschluss eine Aufreinigung der Antikörper auf Protein A- oder G-Säulen.

Ein Vorteil dieser Methode besteht in den geringen Kosten im Vergleich zu gewöhnlichen in vitro Methoden.

Ein Nachteil sind allerdings die Bestandteile der Aszitesflüssigkeit. Diese kann proteolytische Enzyme beinhalten, welche die produzierten monoklonalen Antikörper schädigen können, und endogene Antikörper, die zu einer Senkung der Antikörperspezifität im Anschluss an den Reinigungsschritt führen.

Die Herstellung von in vivo einsetzbaren monoklonalen Antikörpern kann allerdings auch frei von der Verwendung von Tieren in sogenannten Bioreaktoren stattfinden. Die Kultivierung der entsprechenden Hybridomazellen wird hierdurch über einen längeren Zeitraum ermöglicht. Dies ist in der Fähigkeit des Bioreaktors bedingt, frisches Zellkulturmedium zu verabreichen und gleichermaßen verbrauchtes Medium zu entfernen. Auch die Ernte des finalen Antikörpers sowie dessen Aufreinigung kann automatisch durch einen Bioreaktor geschehen.

Allerdings ist die Erstellung und Erhaltung einer geeigneten Umwelt innerhalb eines Bioreaktors and zahlreiche Parameter, deren Einstellung hoch präzise geschehen muss, geknüpft.

Zum einen stellen die Temperatur, Gasdurchsatz und Rührgeschwindigkeit die drei wichtigsten physikalischen Parameter dar. Die chemischen Parameter umfassen neben dem gelösten Sauerstoff- und Kohlenstoffdioxidlevel auch den vorliegenden pH-Wert, die Osmolalität, das Redox Potenzial und zahlreiche Metabolitenspiegel.

Zum anderen sind die biologischen Parameter von großer Bedeutung. Sie umfassen die Konzentration an lebenden Zellen und die generelle Lebensfähigkeit der Zellen. Zusätzlich werden intrazelluläre – und extrazelluläre Parameter gemessen.

 

In vivo Antikörper Reinheit

Geringes Endotoxin Level

Die womöglich wichtigste Fragestellung vor dem in vivo Einsatz eines Antikörpers ist dessen Reinheit bzw. dessen Endotoxingehalt.

Die äußere Zellmembran bestimmter Bakterien besteht unter anderem aus chemischen Verbindungen die als Endotoxin bezeichnet werden. Der Ursprung des Wortes liegt im altgriechischen und bedeutet in etwa „giftige Substanz im Inneren“.

Endotoxine sind Lipopolysaccharide (LPS) die in einen lipophilen Lipid- und einen hydrophilen Polysaccharidanteil unterteilt werden können. Ihre Bedeutung für die in vivo Verwendung von Antikörper erhalten sie durch ihre Aktivierung von zellulären Signalwegen die neben Entzündungsreaktionen sogar eine apoptotische Wirkung auf Zellen zeigen können. Auch den korrekten Ablauf bzw. die Auswertung von zellbasierten Assays können Endotoxine negativ beeinflussen.

Der Endotoxinnachweis geschieht mithilfe des Amöbozytenlysats von Pfeilschwanzkrebsen, dem sogenannten LAL-Test. Die gemessenen Endotoxineinheiten werden im Anschluss pro Milliliter angegeben (EU/mL).

Azid-frei

Neben den Endotoxinen spielen die sogenannten Azide für in vivo Experimente eine weiter wichtige Rolle. Azide, die zu den Pseudohalogeniden gehören, haben drastische Wirkungen auf zelluläre Prozesse. Ihre irreversible Hemmung des Atmungskettenenzyms Cytochrom-C-Oxidase, dem terminalen Elektronenakzeptor innerhalb der Atmungskette, ist besonders wichtig.

Carrier-frei

Auch die Abwesenheit von Carrier-Proteinen, transmembraner Proteine mit wichtiger Funktion im passiven Transport von Substraten, wird vor dem Verkauf von Antikörper für den in vivo Einsatz sichergestellt.

 

In vivo Antikörper Anwendung

T-Zell-Depletion mittels in vivo Antikörpern

T-Zell-Depletion beschreibt die Entfernung oder Senkung von spezifischen T-Zellen und kann das Risiko für eine Graft-versus-Host-Reaktion verringern.

Neutralisierung mittels in vivo Antikörpern

Besonders angesichts der SARS-CoV-2 Pandemie ist die Suche nach neutralisierenden Antikörpern zentraler Bestandteil der Forschung. Die Neutralisierung geschieht durch die Bindung des Antikörpers an ein bestimmtes Antigen. Diese kann zum Beispiel auf der Virusoberfläche sitzen und für den Viruseintritt in die Zelle oder dessen Bindung an zelluläre Rezeptoren verantwortlich sein. Die Antikörper-Antigen Bindung kreiert somit eine physische Barriere und verhindert die Interaktion des Virus mit der Zelle.

Häufige Fragen zur in vivo Antikörper Neutralisierung

Was ist Neutralisierung in der Immunologie?

Die Bindung eines Antikörpers an ein Pathogen und die dadurch (physisch) verhinderte Infektion einer Zelle bezeichnet man in der Immunologie als Neutralisierung.

Führen Antikörper eine Neutralisierung durch?

Nur wenige Antikörper sind in der Lage eindringende Pathogene zu neutralisieren. Die Neutralisierung ist dabei abhängig von der spezifischen Bindungsstelle des Antikörpers.

Wie neutralisieren Antikörper Antigene?

Antikörper können Antigene durch die Bindung an Stellen neutralisieren, die für die Pathogen Infektion besonders wichtig sind.

Was ist ein Virus-Neutralisationstest?

Ein Virus-Neutralisationstest zeigt die Fähigkeit eines spezifischen Antikörpers die Interaktion zwischen einem viralen Oberflächenprotein und einem zellulären Rezeptor durch dessen Bindung physisch zu verhindern.

 

In vivo Bildgebung mittels Antikörper

Neben ihrem therapeutischen Einsatz werden in vivo Antikörper mehr und mehr beliebt für ihre Verwendung für die nicht-invasive in vivo Bildgebung und somit auch für die in vivo Diagnostik.

Hierdurch kann die Forschung an Krankheiten im in vivo Modell geschehen, wodurch eine noch bessere Analyse und Untersuchung von Biomarkern auf Zelloberflächen, durch Therapie beeinflusste Signalwege, metastasierendem Krebs oder generellen Immunreaktionen ermöglicht wird.

Die nicht-invasive in vivo Bildgebung mittels spezifischer Antikörper kann somit die Visualisierung bestimmter Biomarker innerhalb eines ganzen Organismus bewerkstelligen.

Auf lange Frist können hiermit Röntgen-Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und Ultraschall weiter ergänzt werden, da letztere sich auf die Anatomie und Physiologie des Patienten beschränken. Des Weiteren liegt auf dieser neuen Methode eine große Hoffnung zielgerichtete Therapien durch molekulare Beobachtungen weiter verbessern zu können.

 

Therapeutische Antikörper

Wird ein monoklonaler Antikörper für die Bekämpfung einer Krankheit eingesetzt wird von einem sogenannten therapeutischen Antikörper gesprochen. Besonders im Kampf gegen Krebs helfen Antikörper die an die Immun-Checkpoints von T-Zellen binden. In diesem auch als Immun-Checkpoint-Therapie bekannt Prozess blockiert der Antikörper die Interaktion der Krebszellen mit den Immun-Checkpoints auf der Oberfläche der T-Zell-Membran.

Dies hat zur Folge, dass sich die Krebszelle der Immunreaktion und dem Angriff durch die T-Zelle nicht entziehen kann (Immunevasion). Dabei würde die Krebszelle normalerweise die Aktivierung dieser Immun-Checkpoints nutzen, welche ursprünglich durch eine Unterdrückung des Immunsystems eine Überfunktion von Immunzellen bewirken sollen.

Die Benennung solcher therapeutischen Antikörper folgt dabei einem festen Schema: In der Maus erzeugte Antikörper enden immer auf -omab. Der erste seiner Art war 1986 Muromonab-CD3. Da zu dessen Entwicklungszeit die derzeitige Nomenklatur der WHO noch nicht aktiv war, folgt sein Name nicht der nun geltenden Vorgaben.

Der Einsatz von monoklonalen Antikörpern murinen Ursprungs hat allerdings einen großen Nachteil, da diese oft von dem eigenen Immunsystem als „fremd“ erkannt werden, wodurch eine Abwehrreaktion eingeleitet wird. Daher handelt es sich bei den neueren therapeutischen Antikörpern um Antikörper mit ausschließlich humanem Ursprungs (Endung auf -umab).

Zwei weitere Beispiele für die Wirkungsweise von therapeutischen Antikörpern

Blockierung bestimmter überexprimierter Rezeptoren

Damit eine Krebszelle unbegrenzt wachsen kann, muss sie entsprechende Wachstumssignale erhalten. Damit dies geschieht, produziert sie im Vergleich zu anderen Zellen z.B. einen besonders hohen Anteil an HER2-Rezeptoren. Dieser Rezeptor ist für ein solches Wachstums- und Teilungssignal zuständig. Die Bindungen eins anti-HER2 Antikörpers blockiert allerdings dessen Wirkung und verhindert somit das weitere Wachstum der Krebszelle.

Blockierung der Angiogenese

Die Bildung von neuen Blutgefäßen zur Sauerstoffversorgung von Geweben nennt man Angiogenese. Ab einer gewissen Größe eines Tumors wird es für diesen, aufgrund des Mangels an Sauerstoff, notwendig die Bildung von neuen Blutgefäßen mittels Botenstoffe anzuregen. Blockiert man diesen Prozess, schnürt man dem Tumor die Sauerstoffversorgung ab.

 

Therapeutische Antikörper mittels Gentransfer

Einer der neusten Ansätze um die Produktion monoklonaler Antikörper zum Zwecke der Therapie noch effizienter zu gestalten, ist deren Herstellung innerhalb des Patienten selber. Bei dieser Methode spricht man vom in vivo Gentransfer. Ein solches Einschleusen der genetischen Sequenz zur Produktion des Antikörpers kann mittels spezieller Viren (Adenoviren) geschehen. Dabei nutz man die Eigenschaft der Viren ihr eigenes Erbgut in die Wirtszelle integrieren zu können aus.

Dennoch wird dieser neue Ansatz durch Nebenwirkungen wie ein Transfer in die Keimbahn, die Entstehung von Krebs oder ungewollte Reaktionen des Immunsystems auf die Virusinfektion beeinflusst.

Ein nicht-viraler Ansatz beinhaltet die Verwendung von Plasmiden, die in Muskelgewebe transfiziert werden können. Ihr Nachteil liegt allerdings im geringen Expressionslevel des kodierten Proteins.

Der Prozess des Transfers ist dabei einer der zentralsten Ansatzpunkte moderner Wissenschaft. Vor allem die Unterstützung des nicht-viralen Gentransfers durch Elektroporation scheint sehr vielversprechend zu sein. Dabei werden Teile der Gewebemembran mit elektrischen Spannungspulsen permeabel für die verwendeten Plasmide gemacht, was zu einer 10-100-fachen Effizienz des Gentransfers führen kann.

 

Biosimilars

Biopharmazeutika sind biologische Arzneimittel. Ihre Wirkstoffe werden innerhalb lebender Zellen produziert. Dies steht im Gegensatz zu chemischen Arzneimitteln, deren Wirkstoffe synthetisch hergestellt werden.

Läuft das Patent eines Biopharmazeutikums, aus wird es anderen Hersteller möglich dieses Produkt zu kopieren. Dabei wird allerdings nicht der Originalwirkstoff verwendet. Dies hat zur Folge, dass die Zulassung eines Biosimilars ein aufwendiger Prozess ist und dessen Überwachungsmaßnahmen kritisch sind.

Zwar unterscheiden sich die Biosimilars im klinischen Effekt nicht vom Original, den Biologika, trotzdem weisen erstere bedeutende Unterschiede wie zum Beispiel ein verändertes Glykosylierungsmuster auf. Die Aminosäuresequenz der Biosimilars ist allerdings identisch zu ihrem Original.

Vier Charakteristika zeichnen einen Biosimilar aus:

  1. Nach Ablauf des Originalpatents beginnt die Vermarktung
  2. Deutlich günstigerer Verkaufspreis als das Original
  3. Trotz biologischer Variation dem Original besonders ähnlich
  4. Die Wirkung, Qualität und Sicherheit sind nahezu identisch zum Original

Die als Biosimilars bezeichneten Nachahmerprodukte eines therapeutischen Proteins bedürfen trotz ihrer Nähe zum Original Arzneimittel eigener Untersuchungen und Tests hinsichtlich ihrer Wirksamkeit und Sicherheit.

Im Bereich von therapeutischen monoklonalen Antikörpern wurden für Adalimumab, Bevacizumab, Infliximab, Rituximab und Trastuzumab bereits zahlreiche Biosimilars in den letzten Jahren erfolgreich auf den Markt gebracht.