ELISA Kit

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Ein ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Kit enthält alle Materialien und Reagenzien, um Proteine, Antikörper und Viren oder auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Pestizide und Toxine in einer Probe nachzuweisen. Das ELISA-Verfahren gehört zu der Gruppe der Immunassays. Hierbei kann das Vorhandensein eines bestimmten Antigens durch eine antikörpergekoppelte enzymatischen Farbreaktion aufgezeigt werden. Mit niedrigem Material- und Geräteaufwand ist die Analyse von Proben mittels ELISA eine kostengünstige Alternative im Vergleich zu aufwändigeren chromatographischen Methoden wie GC-MS und HPLC.

So funktioniert ein ELISA Kit

Die Mikrotiterplatte ist mit einem Antikörper beschichtet.Das ELISA Kit enthält eine Mikrotiterplatte mit 96 einzelnen Reaktionsräumen. Der Boden der Mikrotiterplatte wurde mit Antikörpern beschichtet, die gegen das gesuchte Antigen gerichtet sind (siehe 1).

 

 


Der fixierte Antikörper bindet ein Antigen aus der ProbeIm ersten Schritt wird die Probe in die Reaktionsräume des ELISA Kits gegeben. Ist das gesuchte Antigen in der Probe enthalten, wird es von den auf der Mikrotiterplatte fixierten Antikörpern gebunden (siehe 2). Anschließend ist es wichtig, die Platte zu waschen, um ungebundene Bestandteile, welche die Messung verfälschen würden, zu entfernen.

 

 

Durch zugabe eines polyklonalen Antikörpers ensteht ein "Sandwich-Komplex"Im zweiten Schritt wird ein weiterer polyklonaler Antikörper, der mit einem Reporterenzym (z.B. Biotin) verbunden ist, zu dem Antikörper-Antigen-Komplex gegeben. Dieser „Detektionsantikörper“ (als „Detection Reagent A“ im ELISA Kit enthaltene Antikörper) bindet an andere Epitope (Bindestellen) des Antigens als der erste fixierte. Auf diese Weise entsteht ein sogenannter „Sandwich-Komplex“ aus Erstantikörper, Antigen und Zweitantikörper (siehe 3).

Ein erneutes Waschen sorgt für die Entfernung nicht gebundener Enzymkonjugate und damit für ein unverfälschtes Messergebnis.  

 

Durch Avidin kann das Enzym HRP als Farbgeber an den "Sandwich-Komplex" gebunden werdenIm Anschluss wird die Eigenschaft von Avidin (Hühnereiweiß), Biotin zu binden, genutzt, um das für die Farbreaktion benötigte Enzym (HRP = horse radish peroxidase) an den „Sandwich-Komplex“ zu binden. Dazu wird mit HRP konjugiertes Avidin (als Detection Reagent B im ELISA Kit enthalten) in die einzelnen Reaktionsräume der Mikrotiterplatte gegeben (siehe 4).

Der Zwischenschritt über die Avidin-Biotin-Bindung dient der Signalverstärkung und ist vor allem dann von Nutzen, wenn die nachzuweisende Verbindung in sehr geringen Mengen vorliegt. Bevor die Farbreaktion eingeleitet werden kann ist es wichtig, nicht gebundene Enzymkonjugate durch erneutes Waschen aus den Reaktionsräumen zu entfernen.

Die enzymatische Farbreaktion wird durch die Zugabe eines zunächst farblosen Substrates (TMB = 3, 3’, 5, 5’- Tetramethylbenzidin) induziert, welches in Gegenwart von Peroxidasen eine dunkelblaue Färbung zeigt. Nach einer bestimmten Reaktionszeit wird das Enzym (HRP) durch Zugabe einer Säure (z. B. Schwefelsäure) denaturiert und die Reaktion somit gestoppt. Dabei schlägt aufgrund der Veränderung des pH-Wertes die Farbe des TMBs von blau nach gelb um.

Die Farbintensität (Extinktion) kann mithilfe eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes photometrisch bei einem Absorbtionsmaximum von 450 nm bestimmt werden. Ein Vergleich der gemessenen Extinktion mit einer zuvor erstellten Standardgeraden ermöglicht, die genaue Quantifizierung der nachzuweisenden Verbindung in der Probe.